Verificación de Limpieza por ATP

¿Qué es el ATP?
Reacción de detección de ATP por bioluminiscencia
Aplicaciones en la industria
Verificación de limpieza por ATP: procedimientos de limpieza, pruebas y acciones correctivas
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Artículos de interés

Maria Teresa La Cruz
Licenciada en Biologia
Publicación: 01/03/2022

Introducción

Actualmente, existen diferentes métodos para la verificación de limpieza en planta, siendo la verificación por ATP una de las más rápidas y precisas: se detecta el ATP (Adenosín trifosfato) por bioluminiscencia, permitiendo determinar si hay materia orgánica en una superficie más allá de la inspección visual.

La verificación de limpieza por ATP permite identificar y corregir rápidamente posibles deficiencias en los protocolos de limpieza y reducir así los riesgos de contaminación microbiana en las plantas de producción.

¿Qué es el ATP?

El adenosín trifosfato o ATP, formado por un ácido nucleico ligado a una cadena de azúcar y fosfato, es la molécula transportadora de energía más abundante en el organismo. Ésta canaliza la energía química de las moléculas provenientes de alimentos y luego la libera para impulsar el funcionamiento de las células. En otras palabras, el ATP es la moneda energética de la vida.

La parte adenosina de la molécula está constituida por adenina, un compuesto que contiene nitrógeno (también uno de los componentes principales de los genes) y ribosa, un azúcar de cinco carbonos. Cada unidad de los tres fosfatos (trifosfato) que tiene la molécula, está formada por un átomo de fósforo y cuatro de oxígeno y el conjunto está unido a la ribosa a través de uno de estos últimos. Los dos puentes entre los grupos fosfato son uniones de alta energía, es decir, son relativamente débiles y cuando las enzimas los rompen ceden su energía con facilidad. Con la liberación del grupo fosfato del final se obtienen siete kilocalorías (o calorías en el lenguaje común) de energía disponible para el trabajo y la molécula de ATP se convierte en ADP (difosfato de adenosina). Todo ello se resume en la fórmula molecular del ATP: C₁₀H₁₆N₅O₁₃P₃.

La molécula del ATP fue descubierta por primera vez en 1929 en el músculo humano en los Estados Unidos por Cyrus H. Fiske y Yellapragada SubbaRow, y de forma independiente en Alemania por el bioquímico Karl Lohmann. Aunque la molécula del ATP fue descubierta en 1929, no se tuvo constancia de su funcionamiento e importancia en los distintos procesos de transferencia energética de la célula hasta 1941, gracias a los estudios del bioquímico germano-estadounidense Fritz Albert Lipmann (ganador del Premio Nobel en 1953, junto con Krebs).

La mayoría de las reacciones celulares que consumen energía están potenciadas por la conversión de ATP a ADP, incluso la transmisión de las señales nerviosas, el movimiento de los músculos, la síntesis de proteínas y la división de la célula. Por lo general, el ADP recupera con rapidez la tercera unidad de fosfato a través de la reacción del citocromo, una proteína que se sintetiza utilizando la energía aportada por los alimentos.

Veámoslo de esta manera: los alimentos al digerirse se convierten en diversas moléculas, como por ejemplo los carbohidratos se convierten en un azúcar simple, glucosa. Las células no aceptan glucosa como “moneda energética”, así que es necesario hacer "un cambio de divisa" que está conformado por una complicada cadena de reacciones químicas, pasar la glucosa a ATP, ya que esa "moneda" sí la acepta la célula. Se obtiene el mismo resultado si hablamos de compuestos como grasas o proteínas, pero el proceso es más engorroso por la conformación química.

Ya que esta molécula se encuentra en toda célula viva, puede relacionarse su presencia con la existencia de materia orgánica; es importante hacer énfasis en que detectar ATP en una superficie no equivale a una prueba de detección microbiológica, ya que no se evalúa la presencia de bacterias sino la presencia de una molécula, pero sí permite realizar una validación de limpieza más precisa y exacta que por inspección visual.

ADP

El adenosín difosfato, abreviado como ADP, es una molécula constituida por una ribosa anclada a una adenina y a dos grupos fosfatos. Este compuesto es de vital importancia en el metabolismo y en el flujo de energía de las células.

El ADP está en constante conversión a ATP, adenosín trifosfato y AMP, adenosín monofosfato. Estas moléculas solo varían en el número de grupo fosfato que poseen y son necesarias para muchas de las reacciones que ocurren en el metabolismo de los seres vivos.

El ADP es un producto de un gran número de reacciones metabólicas que llevan a cabo las células. La energía requerida para dichas reacciones es proporcionada por el ATP, y mediante la ruptura del mismo para la generar energía y ADP.

Además de su función como bloque estructural necesario para la formación de ATP, el ADP también ha mostrado ser un componente importante en el proceso de la coagulación de la sangre. Es capaz de activar a una serie de receptores que modulan la actividad de las plaquetas y otros factores relacionados con la coagulación y la trombosis.

AMP

La adenosina 3',5'-monofosfato es un nucleótido cíclico que funciona como mensajero secundario y que forma parte de los elementos básicos de control bioquímico y de comunicación intracelular en muchos organismos vivos.

Desde su descubrimiento, el AMP cíclico ha sido asociado en los mamíferos con la acción de muchas hormonas, con la secreción endocrina y exocrina, con la liberación de neurotransmisores en la sinapsis y las uniones neuromusculares, entre muchas otras funciones.

Su síntesis es catalizada por tres familias de proteínas asociadas con la membrana plasmática conocidas como adenilciclasas o adenilato ciclasas, capaces de producir el compuesto cíclico a partir de ATP y liberando pirofosfato al interior celular. Su degradación, por otra parte, es mediada por enzimas de la familia de las fosfodiesterasas, que son proteínas solubles que se encuentran mayoritariamente en el citosol.

Estas enzimas, y por lo tanto el AMP cíclico, se encuentran en organismos sumamente diversos, tan simples como las algas unicelulares y bacterias, y tan complejos como animales pluricelulares con complicadas rutas de señalización.

Importancia del ATP en el cuerpo humano

El ATP es clave para que pueda ocurrir el transporte de macromoléculas a través de la membrana plasmática (exocitosis y endocitosis celular) y también para la comunicación sináptica entre neuronas, por lo que se hace imprescindible su síntesis continua, a partir de la glucosa obtenida de los alimentos. Tal es su importancia para la vida, que la ingesta de algunos elementos tóxicos que inhiben los procesos del ATP, como el arsénico o el cianuro, ocasiona la muerte del organismo de manera fulminante.

Reacción de detección de ATP por bioluminiscencia

La detección de ATP para verificar la limpieza de una superficie se basa en el principio de luminiscencia con el complejo luciferina-luciferasa:

El complejo enzimático luciferina-luciferasa convierte la energía química del ATP en luz a través de una reacción de óxido-reducción. La reacción bioluminiscente catalizada por la luciferasa utiliza la energía química contenida en la molécula de ATP para producir la descarboxilación oxidativa de la luciferina a oxiluciferina, dando como resultado la producción de luz. La cantidad de luz emitida es proporcional a los niveles de materia orgánica presente en la muestra que se pretende evaluar. La luz emitida es posteriormente cuantificada usando un equipo denominado luminómetro, que expresa el resultado medido en unidades relativas de luz (URL).

Gracias a esta técnica, puede obtenerse en segundos una medida precisa y exacta de la materia orgánica presente en una superficie luego de su limpieza, permitiendo así determinar si se obtuvieron los resultados esperados o es necesario repetir/mejorar el proceso. Es necesario definir los límites de aceptable-no aceptable (pass o fail) de URL para las superficies en las que se desee verificar la limpieza por detección de ATP, ya que dependerá de la superficie de la que se hable y del uso que se le dé a esta, para poder afirmar si las operaciones de limpieza se realizaron correctamente o no.

Determinar los límites Pass/Fail

Inicie con una base referencial.

Se sugiere 150 RLU para Pass y 300 RLU como Fail.

Realice la evaluación después de una buena limpieza de las superficies durante un periodo definido de tiempo.

Por ejemplo, 3 semanas.

Ajuste los valores Pass/Fail para esas superficies según los datos obtenidos.
Revise regularmente dichos valores.

Por ejemplo, cada 4 meses.

En el caso de superficies irregulares (por ej. productos de plástico o en caso de raspaduras) por regla general no se deberían superar las 500 RLU. En zonas en cuya esterilidad/nivel más alto de pureza tengan que estar presentes, se debería alcanzar un resultado inferior a 20/50 RLU.

Acciones correctivas

Pass: la limpieza se realizó correctamente en ese punto; puede procederse a la desinfección

Fail: la limpieza no se realizó correctamente, por lo que debe repetirse ésta para repetir el análisis de ATP hasta que se alcance un valor adecuado. Es importante monitorear los puntos que den Fail para detectar si existen problemas en el protocolo de limpieza.

Dependiendo de las necesidades de las instalaciones, se puede optar por establecer un plan de acciones correctivas más extenso.

Relación de RLU y CFU

La cantidad y tipos de bacterias que están presentes en una superficie son de gran importancia en los procesos industriales; esto se puede determinar mediante diferentes métodos microbiológicos, como el recuento de viables en placa, lo cual nos permite conocer la cantidad de bacterias vivas presentes en la superficie de interés y se expresa en unidades formadoras de colonias (CFU, por sus siglas en inglés) por área (ejemplo, centímetros cuadrados).

Mediante la verificación de limpieza por ATP, se detecta el ATP proveniente de bacterias vivas además de todas las otras fuentes biológicas de esta molécula, por lo que no se obtiene una medida de cantidad de bacterias (CFU) sino de nivel de limpieza (RLU)

Ya que los valores de CFU y RLU se obtienen a través de diferentes métodos, no se puede esperar que ambas medidas se correlacionen consistentemente; sin embargo, deben realizarse ambos tipos de pruebas para definir los límites de cuándo una superficie está limpia, apta para el proceso industrial.

La verificación de limpieza por ATP proporciona una medida de los riesgos directos que surgen como resultado de los altos niveles de microorganismos más los riesgos indirectos que surgen como resultado de residuos orgánicos que pueden proteger a microorganismos y representar una fuente de nutrientes a estos.

Aplicaciones en la industria

La importancia del monitoreo ambiental para verificar la efectividad de la limpieza o prevenir la contaminación de alimentos por patógenos es bien reconocida. Los alimentos, especialmente los listos para comer, pueden contaminarse con patógenos ambientales como Salmonella y Listeria monocytogenes a través de la contaminación cruzada con el entorno de la planta, incluidas las superficies de contacto, el equipo sucio, el piso, los desagües, el aire y el agua.

¿Por qué el ATP es un buen indicador en la limpieza?

Alta contaminación = Alta cantidad de ATP = Más luz producida en reacción con hisopo recolector = Mayor número de RLUs en el luminómetro.

La presencia de ATP en una superficie es indicador de una limpieza incorrecta o de algún tipo de contaminación. El ATP puede prevenir residuos de alimentos, de suciedad existente, de los propios microorganismos, etc. Una superficie deficientemente higienizada es un lugar potencial para el desarrollo de una contaminación y probable punto de partida de una infección. Eliminando el ATP se eliminará la fuente de alimento para las bacterias evitando así su crecimiento y reproducción.

Se encuentran disponibles comercialmente muchos métodos nuevos, rápidos y automatizados para las pruebas microbiológicas del entorno de las plantas alimentarias, y se están introduciendo nuevos métodos con regularidad. Sin embargo, su implementación depende de varios factores, incluido el tiempo para obtener el resultado, la especificidad, la selectividad, la precisión y la reproducibilidad. Otras cosas a considerar son la facilidad de uso, el costo, los reactivos, los consumibles, la necesidad de capacitación, la disponibilidad de soporte técnico y la aceptación regulatoria.

La validación de limpieza por ATP es un método rápido, preciso y sencillo que permite tener mejor control de los procesos en planta, garantizando superficies limpias y minimizando los riesgos de contaminación o desarrollo de patógenos.

¿Qué áreas se deberían muestrear?

Todas las áreas que estén en contacto con posibles contaminantes deben considerarse como puntos críticos de un programa de limpieza y desinfección, así como elementos de uso habitual en las plantas de producción. La presencia de cualquier contaminante puede generar un crecimiento bacteriano.

Las zonas de muestreo de cualquier planta deben designarse como puntos de control de ATP en el plan de verificación de limpieza por ATP; las pruebas en dichos puntos deben realizarse de manera rutinaria. asegurando así la calidad del producto y permitiendo detectar rápidamente problemas en la limpieza.Las zonas de muestreo deben corresponder a aquellas donde la mala limpieza puede afectar la calidad del producto.

Los valores de RLU, es decir, los niveles de ATP serán mayores en las zonas más difíciles de limpiar, en los que incluso pueden formarse biofilms. Estas áreas deben ser establecidas como puntos de control para las pruebas y monitoreo de rutina.

La selección de las áreas de muestreo debe considerar del tipo de contacto que representan para el producto:

Contacto directo

Son las superficies que entran en contacto con el producto durante el proceso, por lo que representa un alto riesgo si su limpieza no es la correcta; deben verificarse con frecuencia y suelen tener un bajo límite de Pass de URL.

Ejemplo: tabla de cortar, rebanadoras, utensilios, bandas transportadoras.

Contacto indirecto

Son aquellos lugares donde el producto o contaminantes salpicados pueden transferirse sobre el producto.

Ejemplo: paredes laterales, drenajes, botones/controles de la máquina.

¿Qué hacer o no hacer con los hisopos para superficie?


Aplicar presión suavemente en el hisopo y rotarlo. Pasar consistentemente en el área a evaluar. Después de activar y agitar, realice la medida inmediatamente. Remueva los hisopos usados del luminómetro. Permita que los hisopos estén a temperatura ambiente por al menos 10 minutos antes de realizar la prueba.	Tocar el hisopo o la superficie a evaluar con las manos. Evaluar superficies calientes. Colocar horizontalmente los hisopos después de activarlos. Dejar el hisopo dentro del luminómetro después de reportar el valor. Utilizar hisopos expirados.